Religiøse overbevisninger. Irokesernes overnaturlige verden omfattede adskillige guddomme, hvoraf den vigtigste var Store Ånd, som var ansvarlig for skabelsen af mennesker, planter og dyr og de gode kræfter i naturen. Irokeserne mente, at Store Ånd indirekte styrede almindelige menneskers liv. Andre vigtige guddomme var Tordenskjold og De Tre Søstre, majsens ånder,Modsat Den Store Ånd og de andre gode kræfter stod Den Onde Ånd og andre mindre ånder, der var ansvarlige for sygdom og anden ulykke. Efter irokesernes opfattelse kunne almindelige mennesker ikke kommunikere direkte med Den Store Ånd, men kunne gøre det indirekte ved at brænde tobak, som bar deres bønner til de mindre gode ånder. Irokeserne betragtede drømme som vigtige.Man mente, at drømme udtrykte sjælens ønsker, og derfor var opfyldelsen af en drøm af afgørende betydning for den enkelte.

Omkring år 1800 modtog en Seneca-sæk ved navn Handsome Lake en række visioner, som han mente viste vejen for irokeserne til at genvinde deres tabte kulturelle integritet og lovede overnaturlig hjælp til alle dem, der fulgte ham. Handsome Lake-religionen understregede mange traditionelle elementer af irokesisk kultur, men inkorporerede også kvækertro og aspekter af hvid kultur. I 1960'erne blev der påMindst halvdelen af irokeserne accepterede Handsome Lake-religionen.

Religiøse udøvere. Der var ingen religiøse specialister på fuld tid, men der var mandlige og kvindelige specialister på deltid, kendt som troens vogtere, hvis primære ansvar var at arrangere og udføre de vigtigste religiøse ceremonier. Troens vogtere blev udpeget af matrisib-ældste og havde betydelig prestige.

Ceremonier. Religiøse ceremonier var stammeanliggender, der primært vedrørte landbrug, helbredelse af sygdomme og taksigelse. I den rækkefølge, de fandt sted, var de seks største ceremonier ahorn-, plante-, jordbær-, grøn majs, høst- og midvinter- eller nytårsfestivalerne. De første fem i denne rækkefølge involverede offentlige bekendelser efterfulgt af gruppeceremonier, der omfattede taler af vogterne af deNytårsfesten blev normalt afholdt i begyndelsen af februar og blev markeret med drømmetydninger og ofringen af en hvid hund, der skulle rense folket for ondskab.

Kunst. En af de mest interessante irokesiske kunstformer er den falske ansigtsmaske. Maskerne bruges i False Face Societys helbredelsesceremonier og er lavet af ahorn, hvid fyr, lind og poppel. Falske ansigtsmasker er først udskåret i et levende træ, derefter skåret fri og malet og dekoreret. Maskerne repræsenterer ånder, der afslører sig for maskemageren i en bøn og et tobaksbrændende ritual.udføres før masken udskæres.

Medicin. Sygdom og lidelse blev tilskrevet overnaturlige årsager. Helbredelsesceremonier bestod af shamanistiske gruppepraksisser rettet mod at formilde de ansvarlige overnaturlige agenter. En af helbredelsesgrupperne var False Face Society. Disse samfund fandtes i hver landsby og bestod, bortset fra en kvindelig vogter af de falske ansigter, der beskyttede det rituelle udstyr, kun af mandligemedlemmer, der havde drømt om at deltage i False Face-ceremonier.

Døden og livet efter døden. Når en sachem døde, og hans efterfølger blev udnævnt og bekræftet, blev de andre stammer i Ligaen informeret, og Ligaens råd mødtes for at udføre en kondolenceceremoni, hvor den afdøde sachem blev sørget over, og den nye sachem blev installeret. Sachems kondolenceceremoni blev stadig afholdt i Iroquois-reservater i 1970'erne. Kondolenceceremonier blev også praktiseret for almindelige mennesker. II tidlig historisk tid blev de døde begravet i siddende stilling vendt mod øst. Efter begravelsen blev en fanget fugl sluppet løs i den tro, at den bragte den afdødes ånd med sig. I tidligere tider blev de døde efterladt synlige på et træstillads, og efter et stykke tid blev deres knogler deponeret i et særligt hus for den afdøde. Irokeserne troede, som nogle stadig tror i dag, atEfter døden begav sjælen sig ud på en rejse og en række prøvelser, der endte i de dødes land i den himmelske verden. Sorgen over de døde varede et år, hvorefter man mente, at sjælens rejse var afsluttet, og man holdt en fest for at markere sjælens ankomst til de dødes land.