Religiøs tro. Den overnaturlige verdenen til Iroquois inkluderte mange guddommer, hvorav den viktigste var Great Spirit, som var ansvarlig for skapelsen av mennesker, plantene og dyrene og de gode kreftene i naturen. Iroquois trodde at Great Spirit indirekte ledet livene til vanlige mennesker. Andre viktige guder var Thunderer og de tre søstrene, åndene til mais, bønner og squash. I motsetning til Den Store Ånd og de andre gode krefter var Onde Ånd og andre mindre ånder ansvarlige for sykdom og annen ulykke. I det irokesiske synet kunne vanlige mennesker ikke kommunisere direkte med Great Spirit, men kunne gjøre det indirekte ved å brenne tobakk, som førte bønnene deres til de mindre gode ånder. Iroquois betraktet drømmer som viktige overnaturlige tegn, og seriøs oppmerksomhet ble gitt til å tolke drømmer. Det ble antatt at drømmer uttrykte sjelens ønske, og som et resultat var oppfyllelsen av en drøm av største betydning for individet.

Rundt 1800 mottok en Seneca sachem ved navn Handsome Lake en rekke visjoner som han mente viste veien for irokeserne til å gjenvinne sin tapte kulturelle integritet og lovet overnaturlig hjelp til alle de som fulgte ham. Handsome Lake-religionen la vekt på mange tradisjonelle elementer i den irokesiske kulturen, men inkorporerte også Quakertro og aspekter ved hvit kultur. På 1960-tallet aksepterte minst halvparten av det irokesiske folket Handsome Lake-religionen.

Religiøse utøvere. Heltidsansatte religiøse spesialister var fraværende; men det var deltids mannlige og kvinnelige spesialister kjent som trosbevarere, hvis primære oppgaver var å arrangere og gjennomføre de viktigste religiøse seremoniene. Troens voktere ble utnevnt av matrisib eldste og ble tillagt betydelig prestisje.

Seremonier. Religiøse seremonier var stammeanliggender Bekymret primært med jordbruk, helbredelse av sykdommer og takksigelse. I rekkefølgen av forekomsten var de seks store seremoniene lønn, planting, jordbær, grønn mais, høsting og midtvinter- eller nyttårsfestivaler. De fem første i denne sekvensen involverte offentlige bekjennelser etterfulgt av gruppeseremonier som inkluderte taler av troens voktere, tobakksoffer og bønn. Nyttårsfestivalen ble vanligvis holdt i begynnelsen av februar og var preget av drømmetydninger og ofringen av en hvit hund som ble tilbudt for å rense folket for ondskap.

Kunst. En av de mest interessante irokesiske kunstformene er den falske ansiktsmasken. Brukt i herdingsseremoniene til False Face Societies, er maskene laget av lønn, hvit furu, basswood og poppel. Falske ansiktsmasker blir først skåret ut i et levende tre, og deretter kuttet friog malt og dekorert. Maskene representerer ånder som åpenbarer seg for maskemakeren i en bønn og tobakksbrenningsritual utført før masken blir skåret ut.

Medisin. Sykdom og sykdom ble tilskrevet overnaturlige årsaker. Herdingsseremonier besto av gruppesjamanistiske praksiser rettet mot å forsone de ansvarlige overnaturlige agentene. En av kurergruppene var False Face Society. Disse samfunnene ble funnet i hver landsby, og bortsett fra en kvinnelig vokter av de falske ansiktene som beskyttet det rituelle utstyret, besto de bare av mannlige medlemmer som hadde drømt om å delta i falske ansiktsseremonier.

Døden og etterlivet. Da en sachem døde og hans etterfølger ble nominert og bekreftet, ble de andre stammene i forbundet informert og ligarådet møttes for å utføre en kondolanseseremoni der den avdøde sachem ble sørget og den nye sachem ble installert. Sachems kondolanseseremoni ble fortsatt holdt på Iroquois-reservatene på 1970-tallet. Kondolanseseremonier ble også praktisert for vanlige mennesker. I tidlig historisk tid ble de døde begravet i sittende posisjon vendt mot øst. Etter begravelsen ble en fanget fugl løslatt i den tro at den bar bort ånden til den avdøde. I tidligere tider ble de døde etterlatt utsatt på et trestillas, og etter en tid ble beinene deres avsatt i etden avdødes spesielle hus. Iroquois trodde, som noen fortsetter å tro i dag, at etter døden la sjelen ut på en reise og rekke prøvelser som endte i de dødes land i himmelverdenen. Sorg over de døde varte i et år, på slutten av denne tiden ble sjelens reise antatt å være fullført og en fest ble holdt for å markere sjelens ankomst til de dødes land.